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                華西重磅研究榮登Nature Medicine,和瑞基因cSMART技術力助項目完成

                發布時間 :2020/05/06 來源 :和瑞基因

                Safety and feasibility of CRISPR-edited T cells in patients with refractory non-small cell lung cancer

                四川大學華西醫院胸部腫瘤科盧鈾教授團隊聯合多家公司機構以及和瑞基因近日取得一項新成果,他們利用CRISPR-Cas9敲除了T細胞的PD-1基因,然后體外擴增后回輸患者體內用于治療經多線治療失敗的非小細胞肺癌患者。該項I期臨床試驗入組12名非小細胞肺癌患者,評估了CRISPR-Cas9編輯T細胞的安全性和可行性。該里程碑性工作標志著基因編輯在癌癥精準診療的臨床應用中邁出重要一步。這項重要研究結果日前以article的形式在線發表在Nature Medicine雜志上(IF=30.6)。

                PD-1又稱為程序性死亡受體1,是一種重要的免疫抑制分子,其一旦與腫瘤細胞上的配體PD-L1結合,就會阻斷T細胞對腫瘤細胞的殺傷。研究人員通過采集受試者的外周血,利用CRISPR-Cas9技術敲除患者T細胞中的 PD-1基因,然后擴增這些基因編輯過的細胞,再將它們回輸到患者體內。所有治療相關的副反應為1-2級。

                CRISPR能幫助研究人員快速有效地對基因組進行有針對性的切割,它的特異性和易用性使其成為了頗具潛力的工具。然而,該技術卻存在著脫靶風險——不僅切割目標位點,在具有相似序列的非預期位置上也可能會發生切割。這些脫靶切割可能發生在整個基因組中,帶來大量非靶序列的SNVs和InDels,導致產生損害細胞功能或直接殺死細胞的有害突變,這將大大限制CRISPR的臨床應用。在臨床轉化中,使用能準確尋找脫靶位點的方法有重要意義。

                在本研究中,研究人員首先基于gRNA序列,利用sgRNAcas9預測出了18個可能的脫靶位點(off-target)。針對這18個off-target區,和瑞基因設計了36對背靠背式的引物,使用專利的cSMART(環化單分子擴增和重測序技術)技術對這12個患者的編輯細胞樣本進行了高深度靶向測序(20,000 x),檢查這些預測的脫靶位點突變。結果顯示off-target位點的突變頻率較低(中位突變頻率為0.05%(0-0.25%)。且絕大部分脫靶突變位于基因間區(48.1%)和內含子區(35.1%),這些區域對編碼基因不會造成顯著影響。即利用高靈敏度cSMART技術成功證實,本研究中基因編輯的安全性和可行性并未受到編輯脫靶效應的影響。

                然而通過計算機模擬預測gRNA脫靶位點存在一定的局限性,盧鈾教授團隊在和瑞基因公司合作下又采用全基因組測序評估脫靶效應。該方法能全方位精準地對基因編輯的細胞進行off-target檢測,尤其是對于未知突變的檢測將更為準確。研究人員利用Cas-OFFinder軟件在全基因組范圍內預測出了2086個off-target位點,而WGS分析發現這2086個off-target區(± 15 bp),并未發生Indel事件。然后我們又將區間擴展至off-target位點上下游200 bp內,發現在其中的53個位點處檢測到了84個Indel,而這些Indel全都出現在repeat區,不是真正的脫靶位點。

                Figure 3: Off-target analysis by next generation sequencing (NGS) and whole genome sequencing (WGS).

                在這項研究中,和瑞基因通過cSMART專利技術實現了超低頻檢測,并從深度(20,000x)和廣度(WGS,100x)兩個維度針對CRIPSR脫靶事件進行了全面檢測與評估,從分子層面上初步證實CRISPR-Cas9編輯T細胞的安全性和可行性,在NSCLC免疫治療創新性探索中邁出重要一步。

                 

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